분자생물학실험-라이게이션 및 형질전환
00.00
음성: 라이게이션 및 형질전환 실험을 위한 실험테이블 모습입니다.
00.08
음성: 벡터와 인서트 디엔에이를 소량 취해서 빈 이튜브에 차례대로 넣어줍니다. 라이게이션 버퍼를 세번째로 넣어줍니다.
자막: 벡터는 보통 시약회사에서 구입하거나, 제한효소 처리를 통해서 실험자가 만들 수 있습니다.
Insert DNA는 PCR을 한 결과물 등을 이용합니다.
00.55
음성: 라이게이즈 효소는 항상 냉동상태로 두어야 효율이 떨어지지 않습니다. 지금 보이는 노란 용기는 영하 20도 온도로 유지시켜주는 용기이며 여기에 효소 튜브가 보입니다.
자막: 효소는 항상 -20도씨 이하로 보관해야 하며, 실험할 때에도 실온에의 노출은 최대한 피해야 함(실온 노출이 반복되면 효소 활성이 점차 저하됨)
01.05
음성: 마지막으로 효소를 튜브에 넣어줍니다. 마지막으로 넣어주는 이유는 효소의 활성이 실온에 노출되어 저하되는 것을 막아주기 위함입니다. 다 넣은 후 가볍게 튜브를 쳐주어서 반응액들이 잘 섞이게 해줍니다. 보통 라이게이션은 실온에서 반응이 진행됩니다.
자막:라이게이즈 효소의 종류에 따라 최적 반응 온도는 다양합니다.
(이 실험에 사용된 효소는 실온에서 최적의 반응을 보여주는 효소입니다.)
01.44
음성: 2시간 정도 라이게이션 반응을 시켰습니다. 라이게이션이 완료된 내용물을 컴피턴트 셀이 들어있는 튜브에 옮겨줍니다. 빨간 용기에서 꺼낸 튜브에 컴피턴트 셀이 있습니다.
자막: 파이펫에 팁을 끼울때는 파이펫 끝에 손이나 옷 등이 닿지 않도록 합니다.(오염 방지)
컴피턴트 셀이란 형질전환능(외부 DNA를 자기 내부로 도입시킬 수 있는 능력)이 있는 대장균 세포를 말합니다.
02.13
음성: 컴피턴트셀이 들어있는 튜브를 힛블럭에 넣고 40여초간을 기다립니다. 형질전환세균에 열충격을 주게 되면 세포막이 약해져서 이때 외부 디엔에이가 대장균 내로 도입되게 됩니다. 40여초가 지나면 이 튜브를 곧바로 아이스에 3분여간 넣어줍니다. 열을 식혀주는 과정인데 신속하게 열을 식혀주어야만 대장균이 죽는 것을 방지할 수 있습니다.
자막: 반응온도 및 시간 역시 실험균주에 따라 다양하게 조절할 수 있습니다. (열을 가했다가 급속히 식혀주는 실험의 흐름은 동일)
02.50
음성: 현재의 상태에는 배양액이 모자라므로 신선한 배지를 컴피턴트 셀의 튜브에 더 넣어줍니다. 이 배양액을 통해 균주가 자라나게 됩니다.
자막: 이 배양액에는 항생제가 포함되어 있지 않습니다. 세포 내부로 도입된 벡터에 항생제저항성 유전자가 존재하지만, 현재는 이를 발현할 시간이 불충분하므로 항생제가 포함된 배지에 넣어주면 모두 죽어버리게 됩니다.
03.14
음성: 배지를 넣어준 튜브를 37도씨 인큐베이터에 넣어줍니다. 대장균의 최적의 서식 온도를 맞춰주는 것입니다. 이 배양시간은 보통 40여분 정도면 충분합니다.
03.28
음성: 40여분이 지나면 튜브를 꺼내어 실험대로 이동합니다.
03.44
음성: 40여분 배양이 끝난 튜브에는 수많은 대장균이 있게 됩니다. 이를 일부 취해서 엘비플레이트에 뿌려주고 고르게 도말해줍니다. 도말하는 과정을 스프레딩이라 하는 데 이 과정에 힘을 세게 주면 고체 배지가 찢어질 수 있으므로 가볍게 문질러줘야 합니다. 다른 세균의 오염을 방지를 위해서 알코올램프를 켜두는 것이며, 스프레딩 할 때 눈으로 보아 뿌려주었던 배양액이 다 마르게 되면 잘 도말이 된 것입니다.
자막: 이 고체배지에는 항생제가 포함되어 있습니다. 앞서 40여분간의 배양을 통해 항생제저항성 유전자의 산물이 발현되어 있기 때문에 벡터가 도입된 세포들은 살아남게 됩니다. (항생제가 없다면, 벡터가 포함된 세포와 그렇지 않은 세포를 구별할 수 없게 됨)
04.45
음성: 스프레딩한 플레이트를 37도씨 인큐베이터에 넣어 하룻밤 배양합니다.
05.05
음성: 하룻밤이 지났습니다. 플레이트를 꺼내어 콜로니를 관찰합니다. 많은 콜로니들이 자랐음을 확인할 수 있습니다. 각 콜로니들은 우리가 넣어준 벡터 디엔에이가 잘 도입된 대장균들이 자란 것입니다. 실험이 성공적으로 끝났습니다.
자막: 각 콜로니는 하나의 세포가 아니라 수만~수십만의 대장균이 모여있는 집락입니다. 이 콜로니들을 액체배지로 옮기어 더 배양하는 것이 plasmid DNA 배양입니다. (대장균 배양을 통해서 우리가 원하는 plasmid DNA를 대량으로 생산할 수 있음)
댓글