분자생물학실험-플라스미드 DNA 추출(미니프랩)
00.00
음성: 플라스미드 DNA 추출 실험을 위한 실험 테이블 모습입니다.
00.08
음성: 우선 밤새 균주를 배양한 배양액을 일부 취해서 원심분리관, E-tube에 옮겨 담습니다.
00.40
음성: 균주만을 따로 모으기 위해서 원심분리를 시행합니다. 2개의 튜브를 서로 대칭이 되도록 넣어줍니다.
자막: 대장균을 8,000rpm 이상에서 원심분리합니다.
01.41
음성: 원심분리가 끝났습니다. 튜브를 꺼내어 확인하면 튜브 바닥에 균주가 침전되어 있는 것을 볼 수 있습니다.
02.00
음성: 바닥에 붙은 균주가 필요하므로, 상층액은 폐액통에 버려줍니다.
자막: 이 때 상층액을 완전하게 제거하는 것이 이후 실험과정에서의 효율을 높여줍니다.
02.17
음성: 솔루션 1을 적정량 취해서 튜브에 넣어준 후 파이페팅과 볼텍싱을 통해서 균주를 잘 풀어줍니다. 균주가 제대로 풀리지 않으면 다음 단계에서의 효율이 떨어지므로 충분히 풀어주는 것이 좋습니다.
자막: 솔루션 1을 250ul 첨가한 후 vortexing 을 통해서 세포를 완전하게 풀어줍니다.
03.35
음성: 새로운 팁으로 교체해 준 후, 솔루선 2를 적정량 취해서 아까의 튜브에 넣어줍니다. 이 단계부터는 볼텍싱 등 세차게 흔들어주게되면 DNA 도 조각조각 파괴되므로 조심스럽게 위아래로 흔들어주어야 합니다. 세포가 깨어지면서 끈적끈적한 상태로 변한 것을 볼 수 있습니다
자막: 솔루션 2를 250ul 첨가한 후 3~4회 차분히 뒤집어준다. (vortexing 금지!)
04.46
음성: 새로운 팁으로 교체해 준 후, 솔루션 3을 적정량 취해서 튜브에 넣어줍니다. 솔루션 3은 앞단계에서 넣어준 솔루션2의 작용을 중화시켜주는 역할을 하며, 흰색 가래침 같은 응집이 생성되었음을 볼 수 있는데 여기에는 단백질, 지질 등의 물질 등이 혼합되어 있습니다.
자막: 솔루션 3을 350ul 첨가한 직후 바로 3~4회 차분히 뒤집어 준다. (vortexing 금지!)
06.07
음성: 솔루션 3까지 넣어 반응시킨 후 원심분리를 시행합니다. 이 과정을 통해서 단백질등의 물질은 튜브 바닥으로 침전되고, 우리가 원하는 플라스미드 DNA는 상층액 부분에 존재하게 됩니다.
자막: 12,000rpm, 4 ℃로 10분간 원심분리한다.
07.05
음성: 원심분리한 튜브에서 상층액만을 조심스럽게 취한 후 스핀컬럼에 옮겨 담습니다. 이 후 원심분리를 시행하면 플라스미드 DNA만이 컬럼안에 존재하는 필터에 붙어 있게 되고, 나머지 이물질들은 필터를 통과하며 튜브 바닥으로 떨어지게 됩니다.
자막: 상층액을 DNA binding column으로 옮긴 후 13,000rpm에서 1분간 원심분리한다.
08.08
음성: 스핀컬럼의 모습이 보입니다.
08.14
음성: 원심분리를 시행합니다.
08.26
음성: 원심분리가 끝나면 튜브 바닥에 있는 액체는 폐액통에 버려줍니다. 플라스미드 DNA는 필터부분에 붙어 있습니다.
08.48
음성: 이제 워싱 솔루션을 스핀컬럼에 넣어줍니다. 워싱 솔루션은 필터에 붙어있는 플라스미드 DNA를 워싱해주고, 일부 필터에 남아있는 이물질들을 필터에서 씻겨나가도록 해주는 역할을 합니다.
자막: 워싱 솔루션 4를 700ul 첨가한 후 , 13,000rpm에서 1분간 원심분리한다
09.20
음성: 원심분리를 시행합니다.
09.38
음성: 원심분리가 끝났습니다. 컬럼 바닥에 있는 액은 폐액통에 버려준 후, 아무 것도 넣지 않은 상태의 스핀컬럼을 다시 한번 원심분리 해줍니다. 이 과정을 통해서 워싱솔루션을 완전하게 제거하게 됩니다.
자막: 13,000rpm에서 1분간 원심분리한다. (에탄올 성분을 완전히 날려버리기 위함)
10.20
음성: 원심분리가 끝났습니다. 스핀컬럼에서 필터가 있는 부분만을 꺼내서 새로운 이튜브로 옮겨 끼워줍니다. 이제 필터에 붙은 플라스미드 DNA를 추출하는 과정이 남았습니다.
자막: DNA binding filter column을 새로운 1.5ml e-tube에 옮기어 장착한다.
10.38
음성: 일루션 버퍼를 스핀컬럼의 필터 부분에 정확하게 떨어뜨려줍니다. 필터가 완전히 젖도록 필터의 중앙에 잘 떨어뜨려 주는 것이 중요합니다. 2~3분 정도 기다려 주어 플라스미드 DNA가 충분히 일루션 버퍼를 흡수하도록 해줍니다.
자막: 일루션 버퍼를 50ul첨가한 후, 최소한 1분간 기다린다.
11.28
음성: 원심분리를 시행합니다. 이제 튜브 바닥으로 떨어지는 용액에 우리가 원하는 플라스미드 DNA가 존재하게 됩니다.
자막: 13,000rpm에서 1분간 원심분리한다.
11.45
음성: 원심분리가 끝났습니다. 지금 보이는 부분에 플라스미드 DNA가 들어있습니다. 이의 확인은 DNA 전기영동 실험을 통해서 하게 됩니다.
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