분자생물학실험-단백질 발현 및 정제
00.00
음성: plasmid DNA 배양을 위한 실험테이블 모습입니다.
00.07
음성: 알코올을 실험테이블과 기구들을 뿌려줍니다. 미생물을 이용하는 실험이지만, 다른 미생물 등에 오염이 생길 수 있기 때문입니다.
00.25
음성: 알코올 램프에 불을 붙여줍니다.
자막: 방금 실험테이블이나 손에 뿌린 알코올이 채 마르기 전에 라이터를 켜면 안되겠죠! 손이 탑니다.
00.32
음성: 핀셋을 알코올 램프에 달궈주어 멸균하는 과정입니다. 멸균된 이쑤시개를 하나 집어줍니다.
00.54
음성: 대장균이 자라있는 고체배지를 들어 콜로니 하나를 신속하게 따 줍니다.
자막: 고체배지에 붙어 자라고 있는 콜로니를 멸균된 이쑤시개를 이용해서 액체배지로 옮겨주는 과정.
01.00
음성: 아무것도 없는 액체배지에 이쑤시개에 묻어있는 콜로니를 섞어줍니다.
01.10
음성: 실험과정이 끝났습니다.
01.23
음성: 쉐이킹 인큐베이터에 액체배지 용기를 넣어주고 하룻밤 배양합니다.
자막: 쉐이킹 인큐베이터는 온도, 흔들리는 속도 등을 조절할 수 있습니다. 실험자가 배양하는 균주의 특성에 맞게 온도와 흔들리는 속도를 세팅합니다. (이 실험에서는 37도, 212rpm으로 세팅되었음)
01.50
음성: 다음날 와서 배양 용기를 꺼내어보면 배양이 되었음을 확인할 수 있습니다.
말풍선” 왼쪽에 보이는 튜브 – 하룻밤 배양한 배지(실험군)
오른쪽의 튜브 – 아무것도 없는 빈 배지(대조군)
02.14
음성: 배양한 배양액을 실험테이블로 가지고 옵니다. 배양액 1ml을 취해서 100ml의 빈 배지에 넣어줍니다.
자막: 단백질을 발현하고 정제하기 위해서는 5ml 배지로는 부족하므로 더 많은 용량의 배지에 균주를 배양한 후 발현 및 정제를 진행하는 것이 일반적입니다.
02.50
음성: 이 배지를 37도 쉐이킹 인큐베이터에 4시간 정도 배양해줍니다.
02.58
음성: 배양이 잘 되어 있음을 확인할 수 있습니다.
자막: OD값이 0.6 정도인 상태입니다. 이 시기가 미생물의 생장곡선에서 증식기에 해당하는 상태입니다. (스펙트로미터를 이용하여 OD값을 측정하는 과정은 이 영상에서 생략)
03.10
음성: 배지에 IPTG를 적정량 넣어준 후 하룻밤 배양합니다.
자막: IPTG는 락토즈 유사체로서 미생물에 도입된 벡터의 발현 스위치를 켜 주는 역할을 합니다.
03.43
음성: 배양이 끝났습니다. 배양액을 원심분리 용기에 정확히 같은 양으로 나누어 담습니다. 무게를 정확히 맞추기 위해 양팔저울을 이용합니다.
자막: 원심분리기는 완벽하게 대칭이 되어야 합니다. 비대칭일 경우 큰 사고로 이어질 수 있음
04.54
음성: 원심분리 용기를 원심분리기에 넣고 원심분리를 시행합니다.
자막: 3000rpm으로 5분간 원심분리하는 모습입니다. Rpm이 설정한 속도에 다다를때까지 실험자는 자리를 떠나지 않고 지켜봐야 합니다.
05.57
음성: 원심분리가 끝났습니다. 용기 바닥에 대장균이 뭉쳐있는 모습을 확인할 수 있습니다.
06.31
음성: 소니케이터를 이용해서 대장균을 파쇄하는 과정입니다. 원심분리 한 후 상층액은 빈 용기에 따라 버리고 펠렛만이 남아있는 용기에 버퍼를 넣어주어 바닥에 붙어있는 대장균 펠렛을 풀어줍니다.
자막: 대장균은 파쇄할 예정이므로 과격하게 풀어줘도 무방합니다.
07.03
음성: 풀어진 펠렛과 버퍼를 빈 비이커에 담아준 후 소니케이터에 장착합니다.
자막: 비이커는 얼음에 담겨있습니다. 소니케이션을 진행하면 버퍼액이 온도가 상승하게 되는데 온도가 올라갈수록 단백질이 변성되기 때문에 이를 막기 위함입니다.
07.25
음성: 소니케이터를 켜고 조건을 입력합니다. 보통 2초간 소닉 효과를 주고 2초간 쉬고 다시 2초간 소닉을 주는 방식으로 진행합니다.
자막: 치익~하는 소리가 소닉을 주는 부분입니다.
07.57
음성: 소니케이션을 이용한 대장균 파쇄과정이 끝났습니다. 험실에서는 이 과정을 보통 10~30분 사이 진행하는데, 세포를 완벽하게 파쇄해야만 단백질 추출의 효율이 높아지기 때문입니다.
08.13
음성: 히스택 오픈 컬럼을 이용하여 단백질을 추출하기 위한 실험실 테이블 모습입니다. 파란 부분이 고정상이며, 투명한 액체 부분이 이동상으로 작용합니다.
08.28
음성: 워싱버퍼를 컬럼안으로 흘려줍니다. 워싱버퍼를 흘려줌으로써 고정상에 남아있는 이물질을 씻어주는 데 이러한 과정을 컬럼안정화 라고 합니다.
자막: 파란색의 고정상은 가루 형태이므로 버퍼를 흘려주면 먼지일듯이 일어나게 되지만 곧 다시 가라앉게 되므로 실험에는 지장이 없습니다.
09.24
음성: 컬럼안정화가 끝나면 소니케이션한 용액을 컬럼으로 넣어줍니다. 이 과정 동안 실험자가 원하는 단백질은 고정상에 붙게 되고, 나머지 물질은 고정상을 그냥 통과하여 컬럼 아래로 떨어져 나오게 됩니다.
09.49
음성: 소니케이션 한 용액이 컬럼을 다 통과했습니다. 이제 워싱버퍼를 컬럼으로 흘려줍니다.
10.10
음성: 워싱버퍼는 고정상과의 친화도가 높기 때문에 고정상에 붙어있던 단백질은 고정상과 분리되어 컬럼 아래로 빠져나오게 됩니다. 이제 빠져나오는 용액에 실험자가 원하는 단백질이 들어있습니다.
10.38
음성: 단백질 추출 실험이 끝났습니다. 추출 결과는 SDS-PAGE 실험을 이용하여 확인하게 됩니다.
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