분자생물학실험-HPLC
00.00
음성: HPLC 기기의 모습입니다.
00.07
음성: 시료의 용출 모습을 볼 수 있고, 실험조건을 입력하는 프로그램 화면입니다.
00.22
음성: HPLC도 크로마토그래피인데 이동상으로는 A C N 과 물 2 종류를 사용합니다.
00.38
음성: 화면에 컴퓨터로 입력한 조건이 표시되면서 실행이 되는 부분입니다.
00.54
음성: 수동으로 기기 안의 공기를 빼내고 용매도 빼내는 부분입니다.
01.06
음성: 인젝터 부분인데 분석물을 기기 안으로 주입하는 부분입니다. 주입한 분석물은 컬럼을 통과하게 됩니다.
01.20
음성: 이 부분은 시료를 필터하고, 관 안의 공기를 제거해주는 부분입니다.
01.30
음성: 시료가 컬럼을 지나가게 되는데 시료를 대용량으로 정제할 때는 큰 컬럼을 사용하게 되고, 적은 양의 시료를 분석할 때에는 작은 컬럼을 사용하게 됩니다.
자막: prep. (preparation 용) 컬럼(굵은 관) –일반적으로 시료를 대량으로 정제하기 위해 사용
Anal. (analytical 용) 컬럼(가는 관) – 미지의 시료를 분석하기 위해 사용
01.58
음성: 이것은 디텍터라는 기기입니다. 시료를 측정하는 파장을 지정해 줄 수 있고, 시료가 관을 통과할 때 흡광도 수치가 모니터에 픽으로서 나타나게 됩니다. 실험자는 이 픽의 시간대나 모양 등을 분석하게 됩니다.
02.33
음성: 증류수와 a c n을 기기에 사용하기 위해서는 우선 필터를 해줘야 합니다. HPLC는 상당히 민감한 기기이고 극소량의 샘플도 분석이 가능하기 때문에 불순물이 있게 되면 실험에 큰 오차를 가져올 수 있기 때문입니다.
중력에 의해서는 빠르게 필터할 수 없기 때문에 펌프를 이용해서 플라스크에 음압을 걸어주게 되면 빠르게 필터를 진행할 수 있습니다.
사용하는 필터는 보통 0.22um의 포어를 가지고 있으며 실험자가 사용하는 시료에 따라서 포어의 크기나 필터 자체의 재질 등을 다르게 사용할 수 있습니다.
04.30
음성: 필터를 마치면 다시 병에 옮겨 담고 기기와 연결합니다.
04.48
음성: 이제 실험하기 위한 조건을 입력해 줍니다. 그라디언트 모드로 할지, 시간과 기울기 % 등을 입력해주면 됩니다.
자막: HPLC의 조건은 실험하는 시료에 따라 아주 다양하며 같은 물질이라 해도 정해진 조건이 있는 것은 아님. 처음 실험하는 미지의 시료라면 일반적인 조건으로 먼저 실험을 하면서 그 시료에 가장 맞는 조건을 찾아가면 됩니다.
05.05
음성: HPLC에 연결된 관은 하룻밤만 지나도 미세한 기포들이 생겨나기 때문에 실험 전에 항상 기포를 제거해주어야 합니다. 더 이상 기포가 같이 나오지 않을 때까지 이 작업을 반복해줍니다.
주사기로 제거가 끝나면 기기를 작동시켜서 버퍼를 흘려주면서 기포를 완전히 제거해줍니다. 이때 컬럼으로는 버퍼가 통과하지 않도록 조절한 상태입니다.
자막: 컬럼에 기포가 들어가면 컬럼의 성능이 크게 저하되므로 이 과정은 상당히 중요합니다.
주사기를 이용한 기포제거는 3~4회 정도면 기포가 제거되며, 기기를 작동시켜 기포를 제거하는 과정은 보통 5분 정도면 무난합니다.
06.00
음성: 이제 레버를 돌려서 버퍼가 컬럼을 통과하도록 했습니다. 컬럼을 통과한 버퍼가 관 밖으로 배출되는 것을 볼 수 있습니다. 이 과정을 컬럼 안정화 과정이라 하는데, 이 과정을 20여분 정도 진행하여 컬럼을 워싱해주는 것입니다. 컬럼을 통과해 나오는 버퍼를 디텍터가 검출하면서 그 안에 들은 물질들의 농도를 모니터에 보여주게 됩니다.
06:20
음성:이제 프로그램에 실험조건을 입력합니다. 시간에 따라 버퍼의 농도가 증가하는 조건, 즉 그라디언트모드로 실험을 진행할 것입니다. 진행 시간 및 시료의 통과 속도 등을 입력합니다.
자막
HPLC에서는 그라디언트 모드와 아이소크래틱 모드의 2가지 방법으로 실험을 진행할 수 있습니다. (강의자료 참고)
07:04
시료를 담는 주사기에 빈 버퍼액을 이용해서 2회정도 워싱을 해줍니다. 간단하게 주사액을 담았다가 그냥 버리면 되는 과정입니다. 그리고 시료를 조심스레 주사기로 뽑습니다. 이 때 기포가 들어가지 않도록 하는 것이 중요합니다.
07:46
레버를 열고 주사기를 꽂아 시료를 주입한 후 다시 레버를 돌려 닫아줍니다. 레버에 센서가 있어서 레버를 열었다가 닫게 되면 자동으로 실험이 시작하게 됩니다.
08:07
실험이 진행되는 모습을 보시게 됩니다. 이 때부터는 키보드를 조작해서 빠르게 그래프를 보셔도 무방합니다. 초반에는 버퍼가 먼저 통과하게 되는데 이 역시 디텍터에 검출이 되기 때문에 그래프에서는 지저분한 픽의 형태로 나타납니다. 하지만, 버퍼의 농도가 높아지게 되면서 컬럼에 바인딩했던 시료가 빠져나오게 되면 큰 픽으로 나타나게 됩니다. HPLC에 연결된 매스 기기를 통해서 이 물질의 분자량을 측정할 수 있고 데이터베이스를 이용해서 이 물질이 어떤 물질인지 자동으로 검색할 수도 있습니다.
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